Combaterea biologica a daunatorilor din culturile forestiere cu ajutorul speciilor endemice de ciuperci entomopatogene
- Titlul proiectului: Combaterea biologica a daunatorilor din culturile forestiere cu ajutorul speciilor endemice de ciuperci entomopatogene (Contract nr. 406/2010)
- Partener român: Institutul de Cercetare-Dezvoltare pentru Protectia Plantelor, Bucuresti, Romania (dr. Ana-Maria Andrei)
- Partener străin: Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen, Institut für Biologishen Pflanzenschutz, Julius Kühn Institute (JKI), Darmstadt, Germania (dr. Andreas Leclerque)
Obiective generale urmărite
- Caracterizarea genetica a izolatelor fungice din Romania si stabilirea unei metode moleculare de diagnostic pentru identificarea tulpinilor fungice entomopatogene
- Dezvoltarea unui instrument de diagnostic pentru identificarea specifică din probele de mediu a tulpinilor fungice pentru a evalua persistenţa în câmp si impactul asupra mediului a tulpinilor fungice entomopatogene folosite ca agenti de biocontrol.
- Evaluarea activitatii insecticide a biopreparatelor entomopatogene în culturi forestiere
Rezultatele obtinute contribuie la dezvoltarea unui potential micoinsecticid comerciabil
Caracterizarea genetica a izolatelor fungice din Romania
Cinci izolate fungice obţinute din insecte bolnave şi din mostre de sol din diferite regiuni ale României, care au fost anterior caracterizate ca fiind probabil tulpini de Beauveria brongniartii utilizabile ca agenţi de biocontrol, au fost selectate pentru caracterizarea genetică în cadrul proiectului bilateral. Din culturile pure ale acestor tulpini - denumite în continuare ICDPP # 1-5 - a fost extras ADN-ul genomic. Amplificarea prin tehnici de PCR, purificarea si secventierea au fost efectuate pentru doi markeri genetici separati (în primul rând pentru regiunile ITS din operonul care codifica pentru ARN-ul ribozomal (ARNr) împreună cu gena care codifica pentru subunitatea 5,8 din ARN ribozomal şi în al doilea rând pentru gena ef1a „elongation factor 1 alpha” care codifica pentru subunitatea alfa a factorului de extensie in procesul de traducere la eucariote). In plus, în analiza genetica a fost inclusa si tulpina producatorului de micoinsecticide disponibile în comert sub numele de „Melocont”. Compararea secventelor obtinute cu secvenţele omolog publicate dintr-un set selectat de tulpini de referinţă apartinând colectiei de ciuperci entomopatogene USDA-ARS şi reconstrucţia filogenetica din respectiva aliniere a secvenţelor implicând algoritmului Neighbor Joining, a dat rezultate identice, atât pentru nucleotidele ITS analizate cat şi pentru secvenţele de aminoacizi EF1alpha. In primul rând, evaluarea taxonomica anterioara a speciilor de Beauveria brongniartii a fost confirmată pentru toate tulpinile, cu exceptia uneia dintre tulpini, apartinând altei specii de Beauveria. Un rezultat divergent a fost obţinut pentru izolatul ICDPP # 1, care a fost demonstrat ca aparţinând speciei Beauveria bassiana. In al doilea rând, tulpinile ICDPP # 2-5, împreună cu tulpina producatoare de "Melocont" s-au dovedit a fi strâns înrudite între ele, chiar la nivel infraspecific, formând o subclada compacta din clada Beauveria brongniartii.
Identificarea specifica a unei tulpini prin genotiparea grupului 1 de introni si diagnosticare PCR
Izolatul romanesc ICDPP # 2, o tulpină de biocontrol promiţătoare şi tulpina "Melocont" au fost analizate împreuna pentru determinarea prezenţei grupului de introni „self splicing” în cadrul secventelor care codifica pentru 18S şi 28S din ARNr, rezultând constelatii divergente ale intronilor care despart ambele gene ARNr. Respectivele ADN-uri au fost amplificate şi secventiate iar primer-ii au fost proiectati pentru a permite amplificarea specifică a markerilor corespunzători. Perechile de primeri A si B amplifica un segment din gena 18S ARNr, primerii A fiind specifici pentru tulpina „Melocont” si primerii B pentru tulpina ICDPP#2. Perechea de primeri amplifica o parte din gena 28S ARNr, cu specificitatile tulpinii complementare (primerii C şi E pentru tulpina "Melocont" şi primerii D pentru tulpina ICDPP # 2).
Evaluarea activitatii insecticide a biopreparatelor entomopatogene în culturi forestiere
S-au desfasurat experimente de combatere biologica a carabusului de mai (Melolontha melolontha) din pepiniere silvice, prin utilizarea unor biopreparate pe baza de Beauveria brongniartii, un dusman natural al acestui daunator.Lucrările experimentale au fost instalate într - un număr de 6 pepiniere din Moldova, situate în diferite condiţii staţionale, la altitudini cuprinse între 180 m şi 700 m şi infestate, în general, puternic şi foarte puternic cu larve de cărăbuşi. S-a operat de la început cu doze mari de tratare, respectiv 100 kg/ha, 150 kg/ha şi 200 kg/ha, realizate din aplicarea a câte două tratamente la interval de circa o lună de zile. Rezultatele din primul an de aplicare sunt promiţătoare, mortalitatea produsă prin infecţii cu Beuveria brongniartii atingând valori de până la 100% în unele dispozitive experimentale. Nivelul mortalităţii are tendinţa de a creşte odată cu creşterea dozei de biopreparat administrat în sol, atingând valori medii de pâna la 25% la doza de 100 kg/ha, 40% la doza de 150 kg/ha şi 57% la doza de 200 kg/ha. Majoritatea larvelor au murit în vârstă mare L3, dar prin aplicarea unor doze mari de biopreparat de la începutul programului de combatere biologică, au fost înregistrate încă din primul an de tratare mortalităţi şi la larvele de vârstă mijlocie L2, aspect deosebit de important la utilizarea acestui tip de produse. În cazuri izolate, au fost constatate mortalităţi şi în stadiul de pupă. Valorile mortalităţii au fost influenţate şi de alţi factori (nivelul infestării, condiţiile staţionale, etc), efectul acestora urmând a fi evidenţiat pe parcursul ciclului de cercetare. Aportul adus la mortalitatea generală a dăunătorului în sol de acţiunea biopreparatului atinge valori medii de până la 32,5% la doza de 100 kg/ha, 40% la doza de 150 kg/ha şi 45% la doza de 200 kg/ha, diferenţa fiind atribuită în primul rând modului de prelucrare mecanică a solului, prin care se distrug o mare parte din larve şi pe seama unor factori biotici favorizaţi de această acţiune: prădători (îndeosebi păsări insectivore), parazitoizi. Pentru îmbunătăţirea calităţii biopreparatului românesc au fost colectate mostre de larve infectate în mod natural cu Beuveria brongniartii în unele pepiniere silvice, mizându-se pe o virulenţă superioară a ciupercii în astfel de cazuri.
Vizite de lucru efectuate pe durata proiectului bilateral
- în Darmstadt: Viorel Fatu: 1.6.2010-31.7.2010 si 15.10.2010-30.11.2010.
- în Bucuresti: Andreas Leclerque: 15.8.2010 – 30.9.2010